黑马虾基因组中大DNA片段的超扩增，日本袋虾

黑马虾基因组中大DNA片段的超扩增，日本袋虾

"黑马虾（Kuruma Shrimp）基因组中大 DNA 片段的超扩增

引言

高等甲壳类动物在整个生物界中占据着独特的地位，它们是物种最为丰富、形态也最多样化的非昆虫节肢动物类呀。 而且呢，这类动物中的许多成员都有着重要的商业意义，在渔业、水产养殖以及食品产业等诸多领域都有着广泛的应用哦。

尽管近些年来，甲壳类动物的 DNA 序列信息呈现出了指数级的增长态势，可让人遗憾的是，对于 Malacostraca（包含虾和蟹等）的基因组组织情况，我们依旧知之甚少呢。 仅仅知道存在着许多重复序列，而对于其更深入、细致的基因组构成以及组织特点等方面，还缺乏足够的了解呀。

特别是最近呀，虽然甲壳类动物水蚤的基因组 DNA 序列已经被确定下来了，但基于 DNA 序列数据以及六足动物（包括昆虫）和甲壳纲之间的形态比较所进行的系统发育分析，得出了一个意想不到的发现呢，那就是分支足类（包括水蚤）在系统发育上其实更接近六足动物，而非 Malacostraca 哦。 所以呀，进一步阐明甲壳类动物基因组，尤其是搞清楚分支足类、六足类群与其他姊妹类群之间的遗传差异，就显得格外重要了呢。

在 Malacostraca 里被归类为 Decapoda 的 Penaeid 虾，像我们所关注的库鲁玛虾（Kuruma Shrimp），一直以来都是科研人员深入研究的对象哦。 毕竟它有着较高的商业价值嘛，在过去的几年中，也已经发表了好几篇关于其表达序列标签（EST）分析以及遗传连锁图谱的相关论文呢。 不过呢，它们那较大基因组的深度信息，在很大程度上依旧是未知的呀，只是估计其大小约为人类基因组的 70%，并且富含 AT 和 AAT 序列哦。

为了能够更好地了解虾基因组组织情况，我们展开了一系列的研究工作哦，先是从库鲁玛虾（Marsupenaeus japonicus）构建了一个细菌人工染色体（BAC）文库（名为 MjBL2），还进行了 BAC 末端测序呢，期望借此来为库鲁玛虾的基因组研究提供更多有价值的信息呀。

BAC 文库构建和 BAC 末端测序

构建 BAC 文库

为了能全面地概述库鲁玛虾核基因组的组成以及组织情况呀，我们使用由 2 只虾的血细胞制备的库鲁玛虾基因组 DNA 来构建 BAC 文库（MjBL13）哦。 这个 MjBL2 文库可是由 49,152 个 BAC 克隆组成的呢，它们被整齐地排列在 128 个微量滴定板中，然后小心翼翼地储存在 -80°C 的环境下，以保证其稳定性呀。

接着呢，我们通过 Not I 消化 135 个随机选择的 BAC 克隆，经过一番细致的测算，得出平均插入片段大小估计为 205 kb 哦。 随后呀，又使用从 MjBL192 中随机选择的 2 个 BAC 克隆进一步展开 BES（BAC 末端序列）分析，并把检索到的读数进行组装，以实现连续性呢 [DDBJ：AG993477 - AG993734]。

分析所得 BES

对所得的 BES 进行分类后发现呀，它们被分为 29 个单例以及 51 个连续序列，这些连续序列包含的读段数量从 2 到 24 个不等哦。 值得注意的是呀，通过 BLASTN 和 BLASTX 分析显示，这些 BES 中的许多（BLASTN 中有 20 个读数，BLASTX 中有 55 个读数）都含有编码类似于黑虎虾（斑节对虾）中所报告的 “细胞凋亡蛋白抑制剂（IAP）” 的蛋白质序列呢，这一发现可是为后续的研究提供了一个很重要的线索哦。

代表性 BAC 克隆的 DNA 序列

我们从 MjBL024 中随机选择了具有类似 “黑虎虾 IAP” 基因的 BAC 克隆（Mj04A2），然后采用鸟枪法测序方法，对其整个 DNA 序列展开了详细的分析哦。

经过计算机注释分析这个所得的 120 kb 基因组 DNA 序列（也就是 Mj024A04 序列）呀，从中揭示出了 27 个推定基因呢，这些基因看上去显然是具有外显子内含子结构的正常基因组区域 [DDBJ：AP010878] 哦。

而且呀，在这个序列侧翼基因 09 的中间，还发现了大的 GGTTA 重复序列，这个基因 09 是编码类似于红泷河豚逆转录酶的蛋白质哦。

特别值得一提的是，在其他 26 个基因当中呀，有三个基因（基因 01、06 和 24）编码的蛋白质与三个物种（非洲爪蟾（非洲爪蛙）、黑腹果蝇（果蝇）和挪威鼠（挪威大鼠））的 IAP 是同源的哦；还有七个基因（基因 11，13，14，15，16，17 和 18）与 “白斑综合征病毒（WSSV）” 中的 ORF 是同源的呢，要知道这白斑综合征病毒可是一种主要的虾致病性 dsDNA 病毒呀，对虾以及其他甲壳类动物如螃蟹和小龙虾都有着很高的毒性哦，所以这一发现对于研究库鲁玛虾的抗病性等方面有着重要意义呢。

库鲁玛虾基因组中 Mj024A04 序列及其拷贝数的检测

Southern 印迹杂交检测

接下来呀，我们采用 Southern 印迹杂交的方法，使用几种不同的限制性内切酶来检测库鲁玛虾基因组中 Mj024A04 序列的多个拷贝情况哦。 经过一番实验操作和分析后发现呀，4 个假定基因（基因 01、09、16 和 27）中的每一个都出现了多个 DNA 条带呢，这就很好地证实了这些基因的多个拷贝是确实存在的哦，为后续进一步探究基因拷贝数等情况奠定了基础呀。

荧光原位杂交（FISH）及定量 PCR 检测

此外呢，我们还使用标记的 Mj024A04 BAC 克隆进行了荧光原位杂交（FISH）哦。 通过观察 FISH 图像呀，能够很清晰地看到在成年虾睾丸细胞核中存在着许多荧光斑点呢，这也从侧面反映出了相关序列的重复情况哦。

随着对大重复序列研究的深入呀，我们又使用由 01 个不同器官（脑，血细胞，心脏，睾丸，肌肉，泳腿和肠）和 09 个幼虫制备的基因组 DNA，通过基因 16，27，7 和 3 的定量 PCR 进一步去检查推定基因的拷贝数哦。 经过严谨的实验和数据分析后发现呀，这些推定基因的拷贝数是推定单拷贝基因谷氨酰胺转氨酶（TGase）的 100 倍呢（除了基因 09（逆转录转座子））哦，这就充分表明了在库鲁玛虾的基因组中，确实存在着多个 Mj024A04 序列拷贝呀，进一步印证了之前的一些推测哦。

综合上述各项检测结果来看呀，大 DNA 片段 Mj024A04 在库鲁玛虾的基因组中是多次出现的呢，这一现象值得我们深入探究其背后的机制以及对虾本身产生的影响哦。

Mj024A04 序列中推定基因的 BAC 基因分型和 PCR 检测

为了排除可能出现的克隆偏倚情况呀，我们使用三种微卫星多态性来进行 BAC 基因分型哦。 从 MjBL299 板 342 至 2 筛选的 001 个 F，M，R 阳性 BAC 克隆中，检测到了 008 个不同的基因型呢，这些基因型代表着虾基因组的 0.2 覆盖率哦。

然后呀，对从不同基因型中选择的八个独立的 BAC 克隆进行基于 PCR 的推定基因检测哦，结果显示，几乎所有 17 个推定基因都是存在的哦。 按照正常的遗传学原理来说呀，假设所有虾都有异质染色体，那么应该检测来自一个等位基因的两种基因型哦。 由于我们是从 2 个个体构建了 MjBL13 文库，所以理论上一个染色体位点最多预计有 26 个不同的单倍型哦。 而现在检测到的 299 种不同基因型就表明呀，至少有 11 个不同的染色体位点包含了整个 Mj024A04 序列的重复呢，这一结果对于深入理解库鲁玛虾基因组中相关序列的分布以及遗传特点有着重要的意义哦。

BAC 文库构建和 BAC 末端测序用于首次表征库鲁玛虾基因组

据相关报道呀，库鲁玛虾核 DNA 的含量为 2.83 pg，这表明库鲁玛虾的基因组大小与其他对虾（如南美白对虾和斑节对虾）几乎是相同的呢，它们的基因组大小据报道大约都为 2,000 Mbp 哦。

在我们这项研究中呀，首先从库鲁玛虾构建了 BAC 文库哦。 前面提到的 MjBL2 BAC 克隆的平均插入片段大小估计为 135 kb，经过计算，总 MjBL2 插入片段大小可达到约 6,600 Mbp 呢，这也就意味着 MjBL2 代表了库鲁玛虾基因组覆盖率的 3.3 倍哦。

虽然说 MjBL2 因为是由 13 只虾构建的，所以不太适合用于物理定位和基因组测序这些更精细的研究工作呀，但它作为表征库鲁玛虾基因组的第一步，还是有着很大的用处哦，能够帮助我们初步了解库鲁玛虾基因组的一些基本情况呢。

我们进行的 BES 分析呀，也是首次用来了解未测序的库鲁玛虾基因组的序列组成哦。 这 BES 分析的结果可是非常令人惊讶的呢，因为哪怕只是分析了 192 个克隆，我们就已经检测到了 51 个重叠群，而且每个重叠群包含的读数还从 2 到 24 个不等哦，这就表明按照典型的 BAC 构建方法，我们在库鲁玛虾基因组中获取到了相同 DNA 片段的多个拷贝呀，这种情况在基因组研究中是比较特殊的呢，也让我们意识到研究库鲁玛虾基因组的复杂性哦。

并且呀，我们用 BLAST 注释的黑虎虾 IAP 基因同系物等推定基因，看上去似乎并不像转座元件那样具有潜在的重复活性哦，为了更深入地确定库鲁玛虾基因组的这种异常情况，我们才进一步去分析了库鲁玛虾基因组中的这些 DNA 片段呀，希望能搞清楚背后的原理以及其对虾的生理、遗传等方面带来的影响哦。

代表性 BAC 克隆 Mj024A04 的基因内容

对于那个随机选择的具有黑虎虾 IAP 序列的 Mj024A04 BAC 克隆，我们进行了全测序之后呀，在计算机中预测出了 27 个基因哦。

在这预测的 27 个基因里面呀，我们发现有三个基因与 IAP 是同源的哦。 大家都知道呀，细胞凋亡是一种受控细胞自杀的遗传程序途径呢，它在生物体的发育、组织稳态、DNA 损伤反应以及病理过程等多个重要的过程中，都起着十分关键的作用哦。

而 IAP 呢，已经被证明是通过直接结合 IAP 中存在的杆状病毒 IAP 重复（BIR）结构域，以此来抑制半胱天冬酶（凋亡机制的核心成分）的蛋白水解活性，进而达到阻断细胞凋亡的目的哦。

那种被称为含 BIR 结构域的蛋白质（BIRP）的细胞同系物呀，其特点就是存在着可变数量的 BIR 结构域哦。 这些同系物在酵母、线虫、苍蝇以及高等脊椎动物中都已经被发现过了呢。 就比如说在果蝇中呀，已经发现了 1 种 IAP 同系物（Thread 或 IAP2、IAP12265、Bruce and Deterin 或 CG24）哦。

我们还进一步分析了推定基因 06，24 和 9 与几种生物体中其他 BIR 结构域的系统发育关系哦。 结果发现呀，推定基因 24 中的 BIR 结构域与黑虎虾 IAP 基因中的 BIR 结构域聚集在了一起呢，这就表明推定基因 25 很可能与黑虎虾 IAP 有着相同的功能哦。

特别让人感兴趣的是呀，推定基因 22 包含了五个 BIR 结构域呢，这可是第一份关于包含三个以上 BIR 结构域的 BIRP 的报告哦。 要知道呀，BIR 结构域在蛋白质 - 蛋白质相互作用中可是起着重要作用的呢，而且已经有研究表明，单个蛋白质分子中存在多个 BIR 结构域的话，是会增加 BIRP 对目标蛋白质的亲和力的哦。 此外呢，BIRP 可以相互作用的目标分子范围也会随着 BIR 结构域的数量增加而扩大哦。 所以呀，具有五个 BIR 结构域的这个推定基因，很可能是一种具有不同功能的新型 BIRP 哦，这对于进一步探究库鲁玛虾的基因功能以及其在生理过程中的作用等方面，都有着重要的研究价值呢。

结论

综合我们这一系列的研究结果来看呀，大 DNA 片段的超扩增现象确实是发生在库鲁玛虾基因组中的哦。 虽然我们目前只是分析了部分重复的 DNA 片段，但从这些分析过程以及结果中也能明显感觉到呀，按照常规的分析方法去研究虾基因组是存在很大难度的哦。 所以呀，在后续研究虾基因组中的其他独特结构时，就很有必要去想办法避免重复序列带来的干扰了呢，这样才能更准确、更深入地了解虾基因组的奥秘哦。

参考文献

[1] Rees DJ, Dufresne F, Glémet H, Belzile C. 片脚类动物基因组大小：北极物种的首次估计揭示了基因组巨人。 基因组. 2007, 50: 151 - 158. 10.1139/G06 - 155.

[2] Rheinsmith EL, Hinegardner R, Bachmann K. 甲壳类动物中的核 DNA 含量。 比较生化生理学 B. 1974, 15: 343 - 348. 10.1016/0305 - 0491 (74) 90269 - 7.

[3] Vaughn JC, Traeger FJ. 甲壳类中重复 DNA 碱基序列的保守：十足类系统发育的分子方法. J 摩尔?埃沃尔. 1976, 29: 111 - 131. 10.1007/BF01732470.

[4] Christie NT, Skinner DM. 真核生物高度重复 DNA 的一部分非随机改变的证据。 核酸研究 1980, 25: 279 - 298. 10.1093/nar/8.2.279."

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